研发人员发现在许多癌症中，例如 PDAC（导管胰腺癌）和 MCC（默克细胞癌），STING（干扰素基因刺激蛋白）是被沉默掉的。当前，包括 PD1/PDL1，CTLA-4 抑制剂在内的一些肿瘤治疗方法在试图攻克侵袭性癌症（aggressive cancers），例如 PDAC 和 MCC，但是都无法产生持续的治疗效果，而且还会产生耐受治疗的情况。处于免疫抑制状态的肿瘤一直是癌症治疗的难题。因此，急需探索新型治疗手段来应对此类致死性的癌症。
 

激活肿瘤细胞内的 STING 信号通路可以将「冷」肿瘤微环境转为「热」肿瘤微环境，也就是将肿瘤组织所处的免疫抑制环境转变为免疫激活环境。在本研究中，我们应用 mRNA 脂质纳米粒（LNP）向 PDAC 和 MCC 细胞中传递活性增益功能的 STING-R284S 突变体。本文表明，STING-R284S 的 mRNA-LNP 传递可以探索作为一种新的治疗工具，在重启抗肿瘤免疫反应的同时，克服传统 STING 激动剂的毒性和限制性，这将有望成为治疗那些缺乏 STING 信号通路的癌症的有效手段。
 

STING 信号通路

STING 是天然免疫反应和抗肿瘤反应中非常重要的调控因子。经典的 STING 信号通路可以识别死细胞、肿瘤细胞以及病原体释放的 dsDNA，线粒体 DNA。这些 dsDNA 会被 cGAS（环化 GMP-AMP 合成酶）识别，同时合成能够结合并且激活 STING 的 2『-3』cGAMP。在受到病原体相关模式分子（PAMPs）或者损伤相关的模式分子（DAMPs）刺激后，STING 激活 I 型或者 III 型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的转录，起始天然免疫反应。在癌症细胞中，经常存在大量的损伤 DNA。这些损伤 DNA 会刺激产生依赖 STING 信号通路诱导的 IFNs 和抗肿瘤细胞因子/趋化因子（CXCL10 和 CCL5）。IFNs 会刺激抗肿瘤 T 细胞的增值、对肿瘤组织侵润渗透以及直接杀伤，而 CXCL10 和 CCL5 对于募集肿瘤反应活性的 T 细胞具有非常重要的作用。
 

因此，激活 STING 信号通路被证明是一种转变肿瘤微环境的非常有前景的治疗手段，能够把免疫抑制状态的「冷」肿瘤微环境转变为免疫激活状态的「热」肿瘤微环境。
 

「冷」肿瘤

肿瘤免疫抑制一直是癌症免疫治疗的大难题，给许多恶性肿瘤的临床治疗带来巨大挑战。98% 的胰腺癌患者对于 PD-1/PD-L1 免疫检查点阻断疗法是耐受的。几乎没有任何有效的治疗手段来对付晚期胰腺癌。胰腺癌细胞会处于一种高度免疫抑制的肿瘤微环境，从而抑制免疫系统的攻击和抵抗免疫疗法，因此将这种类型的肿瘤划归为不具有免疫原性的「冷肿瘤」。一般来说，能够侵润肿瘤组织的 CD8+毒性 T 细胞和病人的存活能力直接相关。然而，大多数胰腺癌患者的肿瘤微环境中缺乏具有侵润能力的效应 CD8+T 细胞。研发人员发现，在许多癌症中，例如导管胰腺癌（PDAC）和合默克细胞癌（MCC）STING 被沉默或者表达下调。

02、结果与讨论

研究发现，STING 在 MCC 和其他几种癌细胞中没有表达，包括许多 PDAC 细胞系。首先分析了几个 PDAC 细胞系和患者病变中的 STING 蛋白水平（图 1）。
 

从细胞系分析中可以发现，与原代人真皮成纤维细胞（HDF）相比，STING 蛋白在 AsPC-1、PANC-1 和 Capan-1 细胞中稀少，在 MIA PaCa-2 中几乎检测不到。相反，在所有受试细胞系中都能清楚地检测到周期性 GMP-AMP 合成酶（cGAS）的水平，cGAS 是 STING 的上游激活剂（图 1A）。
 

图 1：在 PDAC 中 STING 被下调。（A）使用指示抗体对 PDAC 细胞和原代 HDF 细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹。GAPDH 用作加载控制。（B）PDAC 病变进行 STING（绿色）和 CK19（红色）染色，并用 DAPI 复染。显示了来自 7 名不同患者的胰腺病变的染色结果。
 

图 2：高效 STING 获得功能突变体的鉴定。（A）稳定表达 STING-WT、STING-V147L、STING-N154S、STING-V155M 或 STING-R284S 的 MIA PaCa-2 细胞用或不用 5 µg/mL dox 处理 48 小时。对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B）稳定表达 STING-WT、STING-V147L、STINGN-154S、STING-V155M 或 STING-R284S 的 MIA PaCa-2 细胞用或不用 5 µg/mL dox 处理。在治疗后 96 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活性测定测定细胞活性（ns：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

然后，研究着手建立一种新的方法，利用 STING 获得功能的基因突变，在 STING 沉默的癌症中重新激活 STING 信号通路。为了筛选这些 STING 获得功能突变体抑制肿瘤增殖的能力，构建了稳定表达强力霉素（dox）诱导的野生型（WT）STING 的 MIA PaCa-2 细胞或者是一个毒刺突变体。STING-R284S 突变体在 MIA PaCa-2 细胞中的表达显著增加早期细胞死亡标记物切割 caspase-3 的表达（图 2A），并抑制细胞增殖，可能通过增加经历细胞死亡的细胞数量（图 2B）。相反，STINGWT 和其他 STING 攻能获得突变体的表达并没有诱导这种效应。值得注意的是，所有功能突变体的 STING 增益显示出比 WT STING 更低的信号（图 2A）。
 

dox 处理可有效诱导两种稳定细胞系中的表达（图 3A-B、图 S1A-B）。与 STING-WT 相比，dox 诱导的 STING-R284S 刺激 STING 下游抗肿瘤细胞因子的表达，如 CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFNb 和 TNF（图 a3C、图 S1C）。此外，与未诱导的细胞和表达 dox 诱导的 STING-WT 的细胞相比，STINGR-284S 的表达增加了切割的 caspase-3 的水平（图 3A、图 S1A），并显著抑制了这些癌细胞的增殖（图 3D、图 S1D）。
 

图 3：dox 诱导的 STING-R284S 的异位表达诱导 PDAC 细胞产生关键的抗肿瘤细胞因子和细胞死亡。（A-C）稳定表达 STING-WT 或 STING-R284S 的 MIA PaCa-2 细胞用或不用 5 µg/mL dox 处理 48 小时。（A）对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B）通过 RT-qPCR 证实 STING-WT 和 STING-R284S 的表达。（C）通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平。未经处理的 STING-WT 细胞的值设置为 1。（D）稳定表达 STING-WT 或 STING-R284S 的 MIA PaCa-2 细胞用或不用 5 µg/mL dox 处理。在治疗后 96 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

图 S1：dox 诱导的 STING-R284S 的异位表达刺激 PDAC 细胞中关键的抗肿瘤细胞因子的产生和癌细胞死亡。（A-C）稳定表达 STING-WT 或 STING-R284S 的 BxPC-3 细胞用或不用 5 µg/mL dox 处理 24 小时。（A）对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B）通过 RT-qPCR 证实 STING-WT 和 STING-R284S 的表达。（C）通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平。未经处理的 STINGWT 细胞的值设置为 1。（D）稳定表达 STING-WT 或 STING-R284S 的 BxPC-3 细胞用或不用 5 µg/mL Dox 处理。在治疗后 72 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

病毒载体不能用来携带「热」STINGR284 突变体，因为 STING 信号通路的激活阻止了许多病毒衍生载体的包装。
 

另一方面，mRNA-LNP 已成为在癌细胞中传递基因表达的有力工具，也是强辅助性 T 细胞 1（Th1）偏向的佐剂。作为测试这一策略的第一步，我们生成了编码 STING-R284S 和 STING-WT 的 mRNAs，并将它们转染到 PDAC 细胞中。与模拟转染细胞相比，在 STING-WT 和 STING-R284S-mRNA 转染的 PDAC 细胞中检测到强烈的 STING 表达（图 4A-B、图 S2A-B）。
 

然而，只有 STING-R284S-mRNA 而不是 STING-WT-mRNA 刺激抗肿瘤细胞因子的产生，如 bCCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN 和 TNF（图 4C、图 S2C）。此外，与 STING-WT-mRNA 不同，STING-R284S-mRNA 的转染显著提高了切割的 caspase-3 水平，并显著降低了癌细胞的增殖率（图 4A、4D、S2A、S2D）。这些结果表明，转染 STING-R284S-mRNA 可以特异性地刺激 STING 信号通路，产生必需的抗肿瘤细胞因子并杀死癌细胞。
 

图 4：转染 STINGR-284S-mRNA 可激活重要的抗肿瘤细胞因子的产生并触发 PDAC 细胞死亡。（A-C）用 0.5 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA 转染 10e4 MIA PaCa-2 细胞。转染后 15 小时，对细胞进行 STING（红色）和切割的 Caspase-3（绿色）染色（A），通过 RT-qPCR（B）确认 STING-WT 和 STING-R284S 的表达，并检测 STING-WT 和 STING-R284S 的 mRNA 水平所示基因通过 RT-qPCR 进行测量，并标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA 转染 0.5x10e4 MIA PaCa-2 细胞。转染后 15 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

图 S2：转染 STING-R284S-mRNA 可激活重要的抗肿瘤细胞因子的产生并触发 PDAC 细胞死亡。（A-C）BxPC-3 细胞转染，0.5 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA。转染后 15 小时，对细胞进行 STING（红色）和切割的 Caspase-3（绿色）（A）、STINGWT 和 STING-R284S 染色，通过 RT-qPCR（B）确认表达，通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。  未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S- mRNA 转染 BxPC-3 细胞。转染后 15 小时，细胞活力为通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定进行测定。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

为了进一步开发一种治疗方法，我们测试了 LNP 是否可以将 STINGR-284S -mRNA 传递到癌细胞中。然而，我们没有观察到 STING-WT 和 STING-R284S 在分别用 mRNA LNP 处理的 MIA PaCa-2 和 BxPC-3 细胞中的显著表达（图 5A 和 S3A，第 2、5 行）。我们测试了将 STING-WT 或 STING-R284S -mRNA -LNP 与 APOE4 混合是否能够促进 mRNA 向 PDAC 细胞的传递。我们发现，APOE4 以剂量依赖性的方式强烈刺激 mRNA LNP 向 PDAC 细胞的传递（图 5A、图 S3A）。与未经处理的细胞相比，在用 mRNA LNP 和 APOE4 组合处理的细胞中，通过 RT-PCR 检测到更高水平的 STING-WT 和 STINGR-284S -mRNA（图 5B，图 S3B）。与仅使用 STING-WT -mRNA 的治疗相比，STING-R284S -mRNA LNP 和 APOE4 的联合治疗也显著增强了关键抗肿瘤细胞因子的表达，如 CCL5、CXCL10、IL29、IL6 和 TNF（图 5C、图 S3C）。
 

此外，LNP 递送的 STING-R284S -mRNA 不仅诱导 PDAC 细胞产生裂解的 caspase-3，而且还显著抑制这些细胞的增殖（图 5A、5D、S3A、S3D）。重要的是，相同的治疗没有抑制 CD8+T 细胞的增殖（图 S3E）。
 

图 5：由 mRNA LNP 传递的 STING-R284S 激活必需的抗肿瘤细胞因子的产生并杀死 PDAC 细胞。（A）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S- mRNA LNP 处理 2x10e4 MIA PaCa-2 细胞，将其与指定浓度的重组人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 小时，对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B-C）10e4 MIA PaCa-2，如（A）所示，使用 10 µg/ml 人 APOE4 蛋白处理细胞。转染后 16 小时，通过 RT-qPCR（B）确认 STINGWT 和 STINGR284S 的表达，并通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D） 0.5x10e4 MIA-PaCa-2 细胞按（B）处理。转染后 16 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

图 S3：由 mRNA LNP 传递的 STINGR284S 激活必需的抗肿瘤细胞因子的产生并杀死 PDAC 细胞。（A） 10e4 BxPC-3 细胞用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA LNP，与指定浓度的重组人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，细胞对 STING（红色）和切割的 Caspase-3（绿色）进行染色。（B-C）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S- mRNA- LNP 处理 10e4 BxPC-3 细胞，这些 LNP 与 10 µg/ml 人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，通过 RT-qPCR（B）证实 STING-WT 和 STING-R284S 的表达，并且所示基因通过 RT-qPCR 进行测量，并标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA-LNP 处理 0.5x10e4 BxPC-3 细胞，其与 10 µg/ml APOE4 蛋白。转染后 16 h，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。（E） 10e4 CD8+T 细胞用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S mRNA LNP 处理，其与 10 µg/ml APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

我们之前的研究表明，STING 在 MCPyV+MCC 细胞系中受到特异性抑制。通过分析已发表的 RNA 序列数据，我们发现在 MCPyV-MCC 细胞系 UISO 中表达，在所有六种经典 MCPyV+MCC 细胞系中几乎检测不到 STING RNA 表达水平：MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa 和 BroLi（图 S4A）。RNA-seq 数据还表明，与其他 MCPyV+MCC 细胞系相比，PeTa 细胞中 STING RNA 的表达略高（图 S4A）。然而，Western blot 分析显示，与 MKL-1 细胞类似，PeTa 细胞中的 STING 蛋白表达完全不易察觉（图 S4B）。因此，这项研究证实，在我们检测的所有经典 MCPyV+MCC 细胞系中，STING 表达均受到抑制。
 

图 S4：STING 在经典的 MCPyV+MCC 细胞系中沉默。（A）根据公布的 RNA-seq 数据计算 MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa、BroLi 和 UISO 细胞中 STING 的 mRNA 水平（HTseq 计数）[87]。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001），（B）使用指定抗体对 PeTa、MS-1、UISO、MCC13 和原代 HDF 细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹。GAPDH 用作加载控制。
 

在 PDAC 细胞中观察到的 STING-R284S-mRNA-LNP 的抗肿瘤活性的鼓舞下，我们测试了我们的 LNP 方法是否可以用于刺激 MCC 细胞也有同样的阳性反应。我们首先使用萤火虫荧光素酶 mRNA LNP 优化 MCC 细胞的 mRNA LNP 输送条件。我们确定 10 ug/ml 的人载脂蛋白 E4 也是将 mRNA LNP 导入 MCC 细胞的理想浓度（图 S5）。
 

与未经处理的 MKL-1 和 MS-1 MCC 细胞相比，STING-WT 和 STING-R284S- mRNA- LNP 处理的细胞中均检测到强烈的 STING 表达（图 6A-B、S6A-B）。然而，只有 STING-R284S-mRNA-LNP 的输送，而不是 STING-WT-mRNA-LNP 的输送，刺激关键抗肿瘤细胞因子 CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN 和 TNF 的 b 表达（图 6C、S6C）。与 STING-WT 相比 mRNA-LNP，用 STING-R284S-mRNA-LNP 处理 MCC 细胞，也提高了切割的 caspase-3 水平，并大大抑制了细胞增殖（图 6A、6D、S6A、S6D）。这些结果表明，STING-R284S-mRNA-LNP 也能诱导受试 MCC 细胞系的抗肿瘤细胞因子表达和细胞死亡。

​图 6：STINGR-284S-mRNA-LNP 可触发 MCC 细胞中重要的抗肿瘤细胞因子的产生和细胞死亡。（A）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA-LNP 处理 10e4 MKL-1 细胞，将其与指定浓度的重组人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B-C）10e4 MKL-1 细胞被处理为在（A）中，使用 10 µg/ml 人 APOE4 蛋白。转染后 16 小时，通过 RT-qPCR（B）确认 STING-WT 和 STING-R284S 的表达，并通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D） 0.5x10e4 MKL-1 电池，在转染后 40 小时，通过滴度 GLO 3D 细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

图 S6：STING-R284S-mRNA-LNP 可触发 MCC 细胞中重要的抗肿瘤细胞因子的产生和细胞死亡。（A）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA-LNP 处理 10e4 MS-1 细胞，将其与指定浓度的重组人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，对细胞进行 STING 染色（红色）和切割的 Caspase-3 染色（绿色）。（B-C）10e4 MS-1 细胞用 1 µg STINGWT 或 STING-R284S-mRNA-LNP，与 10 µg/ml 人 APOE4 蛋白预混合。转染后 16 h，STING-WT 和 STING-R284S 表达增加通过 RT-qPCR 确认（B），并通过 RT-qPCR 测量所示基因的 mRNA 水平，并将其标准化为 GAPDH mRNA 水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为 1。（D）用 1 µg STING-WT 或 STING-R284S-mRNA-LNP 处理 0.5x10e4 MS-1 细胞，并在 0 小时和 24 小时与 10 µg/ml APOE4 蛋白预混合。转染后 40 h，通过滴度测定细胞活力-GLO 3D 细胞活性测定。误差条代表三个独立实验的 SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
 

综上所述，我们证明 STINGR-284S-mRNA-LNP 强烈激活癌细胞中的 STING 信号通路，从而产生关键的抗肿瘤药物细胞因子和癌细胞死亡。

03、结    论

为了克服传统的 STING 激动剂在 STING 沉默的癌症中不起作用的局限性，我们探索了在 STING 沉默的免疫「冷」PDAC 中引入天然存在的组成性活性获得功能 STING 突变体以重新激活抗肿瘤免疫的想法。
 

结果表明，STINGR-284S -mRNA -LNP 可以克服传统 STING 激动剂的毒性和局限性，因此可以作为一种新的治疗方法，用于治疗一系列对当前治疗无效的 STING 缺陷型癌症。

 

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